與競(jìng)爭(zhēng)法相比小分子免疫檢測(cè)夾心法的優(yōu)勢(shì)在哪里？

藥物、環(huán)境污染物、化學(xué)污染物等小分子物質(zhì)的檢測(cè)是臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析等領(lǐng)域的重要課題。幾十年來，免疫檢測(cè)作為一種敏感、直接、經(jīng)濟(jì)的測(cè)量分析系統(tǒng)，一直是目標(biāo)分析物可量化測(cè)量的支柱。免疫檢測(cè)通常分為兩大類，競(jìng)爭(zhēng)法和非競(jìng)爭(zhēng)法，非競(jìng)爭(zhēng)法中最常用的就是夾心法。競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)與夾心免疫檢測(cè)，兩者在檢測(cè)原理、分析性能上有著本質(zhì)性差異。在競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)中，分析物與標(biāo)記的（或固定的）分析物競(jìng)爭(zhēng)有限的特異性抗體。相反，夾心免疫檢測(cè)可以結(jié)合基于過量存在的兩種不同抗體的分析物，賦予更高水平的靈敏度、精度和特異性。

1.檢測(cè)原理差異

競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)原理

在競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定中，通常只采用一株抗體，且反應(yīng)體系中抗體數(shù)量相對(duì)于待測(cè)物質(zhì)數(shù)量是有限或不足的。示蹤劑通過標(biāo)記目標(biāo)分析物的類似物進(jìn)行制備，示蹤劑與樣本中的待測(cè)物共同競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)，被捕獲示蹤劑的數(shù)量與樣本中分析物的濃度成反比關(guān)系。

夾心免疫檢測(cè)原理

在夾心免疫測(cè)定中，通常采用兩株抗體，可與分析物形成“三明治夾心”結(jié)構(gòu)。其中一株抗體被固定在固相載體上，用于從樣本中捕獲分析物，另一株抗體特異性識(shí)別分析物的另一位點(diǎn)，用于構(gòu)建信號(hào)生成系統(tǒng)，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與樣本中分析物濃度存在一定的正比關(guān)系。

表1.夾心與競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的原理差異

檢測(cè)方法	夾心法	競(jìng)爭(zhēng)法
試劑用量	試劑過量	試劑限量
抗體株數(shù)	識(shí)別位點(diǎn)不同的兩株抗體	一株抗體
信號(hào)強(qiáng)度	與分析物濃度成正比	與分析物濃度成反比
信號(hào)響應(yīng)
檢測(cè)結(jié)果	反映被分析物占用 的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量	反映未被分析物占用 的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量

競(jìng)爭(zhēng)法靈敏度主要取決于抗體的結(jié)合能力（平衡常數(shù)），夾心法靈敏度受平衡常數(shù)的影響較低，靈敏度主要取決于分析物存在時(shí)的信號(hào)增益幅度和分析物不存在時(shí)的測(cè)量誤差。從信號(hào)響應(yīng)曲線來看，夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的位置不同，夾心法鉤狀效應(yīng)發(fā)生在抗體高劑量時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)法則發(fā)生在抗體低劑量時(shí)。一般來說，在低背景下測(cè)量強(qiáng)信號(hào)要比測(cè)量?jī)蓚€(gè)弱信號(hào)之間的差異容易得多?；谶@個(gè)原因，夾心法理論上具備比競(jìng)爭(zhēng)法更高的靈敏度。此外，在動(dòng)力學(xué)方面過量使用捕獲和示蹤抗體，有利于抗體-抗原-抗體復(fù)合物的形成，從而提高敏感性。

2.小分子免疫檢測(cè)夾心法優(yōu)勢(shì)的實(shí)踐研究

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在開展小分子夾心免疫檢測(cè)中分析物最小表位距離的研究中，比較了夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)對(duì)不同表位距離模式分析物的檢出限（LOD）、檢測(cè)范圍及特異性。發(fā)現(xiàn)在合適的抗原表位間距下，盡可能避免抗體空間位阻，這時(shí)夾心免疫檢測(cè)比競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)具有更高的靈敏度和更寬的檢測(cè)范圍，更適合用于小分子的測(cè)定。

2.1小分子夾心與競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的初步比較

2.1.1目標(biāo)分析物

研究團(tuán)隊(duì)首先選擇了兩個(gè)典型的半抗原表位三聚氰胺（MEL）和對(duì)硝基苯胺（NIA），并用不同長(zhǎng)度的線性鏈連接子（1-14個(gè)亞甲基）來模擬表位距離，創(chuàng)建了9個(gè)模型分析物，并將其命名為MN1-MN9。此外，為了評(píng)估這兩種免疫分析格式的特異性，在MN3的NIA端添加了一個(gè)甲基，合成了一種新的結(jié)構(gòu)類似物。模型分析物及用于產(chǎn)生檢測(cè)抗體的半抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1.模型分析物和半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)

注：（a）表位距離從2.4到19.0?（a圖下部分）不同的MEL和NIA（a圖上部分）組成的9種模型分析物示意圖。（b）不同間隔臂長(zhǎng)度的MEL半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原M1（n=1），半抗原M2（n=3），半抗原M3（n=5），半抗原M4（n=7），半抗原M5（n=9），半抗原M6（n=11）。（c）不同間隔臂長(zhǎng)度的NIA半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原N1（n=0），半抗原N2（n=2），半抗原N3（n=4），半抗原N4（n=6），半抗原N5（n=8），半抗原N6（n=10）。

表2.模型分析物分子量和表位距離

2.1.2夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的比較

研究團(tuán)隊(duì)選擇了半抗原MEL（M4）的單克隆抗體7A3和半抗原NIA（N4）的單克隆抗體17B3，對(duì)模型分析物MN1-MN9及MN3類似物進(jìn)行夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)。比較了夾心免疫檢測(cè)和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的LOD、檢測(cè)范圍和特異性。在合適的表位距離下（11.6-19.0?），小分子夾心免疫檢測(cè)具有更高的靈敏度和檢測(cè)范圍。MN6-MN9夾心免疫檢測(cè)的LOD非常低（0.00035-0.9nM），檢測(cè)范圍比競(jìng)爭(zhēng)法（LOD為0.001-38.8nM）更寬。MN3類似物的競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)靈敏度與MN3相當(dāng)，而夾心免疫檢測(cè)并不識(shí)別MN3類似物，表明夾心免疫檢測(cè)對(duì)目標(biāo)分析物具有高特異性。

圖2.模型分析物夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的校準(zhǔn)曲線

注：（a）基于單克隆抗體（mAb）7A3的競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)對(duì)MEL、MN1-MN9和類似物的校準(zhǔn)曲線（n=3）。（b）基于mAb 17B3的競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)對(duì)NIA、MN1-MN9和類似物的校準(zhǔn)曲線（n=3）。（c）以mAb 7A3為捕獲抗體、mAb 17B3為檢測(cè)抗體對(duì)MN1-MN9、MEL、NIA和類似物的夾心免疫檢測(cè)的校準(zhǔn)曲線（n=3）。

表3.MN模型分析物夾心與競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的檢測(cè)限和線性范圍

注：夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的檢出限（LOD）定義為使ODmax（IC10）降低10%的分析物濃度。在IC20和IC80之間建立檢測(cè)范圍。/代表陰性結(jié)果。

2.2小分子夾心免疫檢測(cè)優(yōu)勢(shì)的進(jìn)一步驗(yàn)證

為了驗(yàn)證“合適的抗原表位間距下，夾心免疫檢測(cè)比競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)具有更高的靈敏度和更寬的檢測(cè)范圍?！边@一結(jié)論。研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一組新的模型分析物，進(jìn)一步比較了夾心免疫檢測(cè)和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的LOD、檢測(cè)范圍和特異性，結(jié)果與初步研究結(jié)果一致。

2.2.1目標(biāo)分析物

使用廣泛用于人類和獸醫(yī)診所的典型抗菌劑磺胺芐胺（SBA）和諾氟沙星（NOR），合成了兩種新的模型分析物SBA-C2-NOR和SBA-C10-NOR。

表4.模型分析物分子量和表位距離

2.2.2夾心免疫檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)驗(yàn)證

用半抗原SBA的單克隆抗體4D11和半抗原NOR的單克隆抗體N2H3A8，對(duì)模型分析物SBA?C2?NOR和SBA-C10-NOR進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)相比，夾心免疫檢測(cè)對(duì)SBA-C10-NOR（抗原表位距離為13.9?）的敏感性、檢測(cè)范圍和特異性方面，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其中LOD較競(jìng)爭(zhēng)法提高了近30倍。

圖3.模型分析物夾心和競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的校準(zhǔn)曲線

表5.模型分析物夾心與競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)的檢測(cè)限和線性范圍

a.基于4D11和N2H3A8抗體的夾心免疫檢測(cè)結(jié)果。
b.基于4D11抗體的競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)結(jié)果。
c.基于N2H3A8抗體的競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)結(jié)果。

夾心免疫檢測(cè)在小分子檢測(cè)中的主導(dǎo)作用，很大程度上取決于目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)和最佳抗體對(duì)。兩個(gè)抗體識(shí)別分析物的表位距離適當(dāng)時(shí)，會(huì)避免抗體空間位阻，此時(shí)夾心法比競(jìng)爭(zhēng)法免疫檢測(cè)具有更高的靈敏度和更寬的檢測(cè)范圍，更適合用于小分子測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

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