化學發(fā)光免疫分析平臺

發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后在返回到基態(tài)并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同發(fā)光可以分為光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光。

化學發(fā)光（chemiluminescence，CL）是指伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現(xiàn)象。反應體系中的某些物質分子，如反應物、中間體或者熒光物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，使反應產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光?；瘜W發(fā)光分析方法主要是依據(jù)化學發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發(fā)光強度進行檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。

1977年，Halman等將化學發(fā)光與抗原抗體免疫反應相結合，創(chuàng)建了化學發(fā)光免疫分析方法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），相較于傳統(tǒng)免疫技術（放射免疫技術、酶免疫技術、熒光免疫技術等），CLIA具有自動化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢。

化學發(fā)光免疫分析方法類型及其原理

CLIA包含兩個部分，即化學發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫反應系統(tǒng)?；瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子(hν)利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質(在反應劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原或抗體上，或酶作用于發(fā)光底物?；瘜W檢測系統(tǒng)通過光電信號檢測儀檢測發(fā)光強度，最后通過化學發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關系確定被測物的含量。

CLIA根據(jù)標記物的不同可分為三大類，即直接化學發(fā)光免疫分析、酶促化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析。

直接化學發(fā)光

化學發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的免疫測定方法稱為化學發(fā)光免疫分析。直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，他們在化學結構上有產生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體，目前常見的直接化學發(fā)光標記物主要有吖啶酯類化學發(fā)光劑。

用吖啶酯直接標記抗體，與待測標本中相應的抗原發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H₂0₂）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯即可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。

直接化學發(fā)光速度快、試劑穩(wěn)定性好，但靈敏度略低于酶促發(fā)光。

酶促化學發(fā)光

酶促化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLELA)是以酶標記抗原或抗體進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定，酶的濃度決定了化學發(fā)光的強度。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為化學發(fā)光酶免疫分析常用的標記酶，發(fā)光底物以魯米諾、AMPPD為代表。

魯米諾+HRP發(fā)光體系

HRP-CLEIA體系具有發(fā)光時間短(幾秒內瞬時閃光)，發(fā)光強度低、不易測量等缺點，為了解決這一問題，通常在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光增強劑。發(fā)光增強劑主要作用為放大光輸出，增強光信號，提高發(fā)光持續(xù)性，從而提高分析靈敏度和可重復性。

該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H₂O₂和化學發(fā)光增強劑使產生化學發(fā)光。

ALP+AMPPD發(fā)光體系

堿性磷酸酶(ALP)和1，2-二氧環(huán)己烷構成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的化學發(fā)光體系，其中最具代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。該反應體系以堿性磷酸酶標記抗體，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。

電化學發(fā)光免疫分析

在電極上施加一定的電壓或電流時，在電極電化學反應產物之間或電極反應產物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學反應而產生激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時放出能量，此過程即為電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)。電化學發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。

在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體，用三聯(lián)吡啶釕標記抗體，在反應體系內待測標本與相應的抗體發(fā)生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引入TPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光，光的強度與待測抗原濃度成正比。

三種化學發(fā)光免疫分析方法的比較

化學發(fā)光、時間分辨熒光、酶免疫分析對比

臨床應用

CLIA具有特異性強、靈敏度高、準確、操作簡單、快速等優(yōu)點，它將化學分析方法和免疫學分析方法的優(yōu)點融合了起來，已經被廣泛用于生命科學、環(huán)境科學、臨床醫(yī)學和生理學等領域。常見的臨床醫(yī)學應用有：

甲狀腺激素檢測；
生殖激素檢測；
垂體激素和皮質激素檢測；
貧血因子檢測；
腫瘤標志物檢測；
感染性標志物檢測；
感染性疾?。?br /> 糖尿病、胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等；
心臟標志物檢測；
病毒標志物檢測；
過敏性疾?。?br /> 治療藥物檢測；

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